Biotecnología Industrial: Producción de enzimas recombinantes

Este curso contemplará: Aspectos de diseño de experimentos, protocolos y aplicaciones de la producción de enzimas de origen bacteriano expresadas en E. coli. Se discutirá acerca de protocolos específicos de clonación y transformación, análisis básico de secuencias, purificación de proteínas, caracterización cinética de enzimas y modelos matemáticos básicos, optimización de la producción a través de la generación de superficies de respuesta, diseño general de reactores microbianos para la producción de enzimas, usos y aplicaciones de las enzimas en investigación e industria.

TEMARIO

1. Introducción

1.1. ¿Por qué las enzimas? potencial de la biocatálisis en investigación e

industria

1.2. Aplicaciones de las enzimas

1.3. Producción de enzimas

2. Uso de base de datos y análisis de secuencias (Ejercicio: obtención de una

secuencia tipo lacasa).

2.1. Determinación de una secuencia de estudio (lacasa)

2.2. Obtención de secuencias en bases de datos por BLAST (GeneBank,

Uniprot).

2.3. Alineamiento de secuencias / análisis del sitio activo (CLC sequence

viewer).

3. Expresión de enzimas recombinantes / uso de genes sintéticos para

expresión en E. coli. (Ejercicio diseño de primers y análisis de secuencias).

3.1. Principios básicos de clonación y diseño de primers

3.2. Uso de kits comerciales para clonación: principios de PCR, ligación y

transformación en E. coli Top10.

3.3. Screening, Análisis de secuencias, aislamiento de plásmidos y

transformación en células de expresión E. coli BL21.

4. Protocolos de producción de enzimas

4.1. Fermentación e inducción

4.2. Separación y purificación primaria de proteína con cola de histidina.

4.3. Purificación de enzimas mediante técnicas cromatográficas

4.4. Medición de la cantidad y pureza de enzimas

5. Ensayos cinéticos

5.1. Determinación de la actividad enzimática (ejercicio)

5.2. Determinación de parámetros cinéticos, KM, Vmax (ejercicio)

5.3. Diseño de experimentos y protocolos para la determinación de la

estabilidad térmica, efectos de la temperatura y pH.

6. Determinación de variables de optimización. Análisis a escala de laboratorio.

6.1. Fermentación microbiana para la producción de enzimas

6.2. Diseño general y básico de biorreactor de tanque agitado (ejercicio)

6.3. Uso de diseños estadísticos para optimización: diseño factorial 2K

6.4. Generación de superficie de respuesta y optimización en base al modelo

(ejercicio)

7. Escalamiento para la producción a escala industrial

7.1. Criterios de escalamiento (ejercicio).

7.2. Producción industrial de enzimas

8. Conclusiones y recomendaciones

REQUISITOS PREVIOS: Conocimiento de matemáticas nivel de pregrado, Excel nivel intermedio, conocimientos básicos de bioinformática, biología molecular, PCR, química y biología (nivel medio).

CURSO DIRIGIDO A: estudiantes y profesionales en las áreas de biotecnología, alimentos, agroindustria, bioquímica y carreras afines.